2.1 枯草芽孢桿菌生長條件測定

枯草芽孢桿菌屬于細菌的一科，屬于厚壁菌門，在發酵飼料中芽孢桿菌主要發揮兩大作用，一方面是提高飼料的消化性和營養價值，另一方面是產生抗菌肽和細菌素抑制有害菌的生長和腐敗作用，芽孢桿菌不僅可以促進多糖、淀粉和蛋白質的水解，還可以促進共生的乳酸菌生長，具調查攝食枯草芽孢桿菌飼料的動物發育良好，血清中溶菌酶水平提高，致使疾病率與死亡率均顯著下降。

通過圖1、圖2 可以看出，隨著培養基pH 的升高，枯草芽孢桿菌的菌濃度隨之增加；隨著培養溫度的提高，枯草芽孢桿菌的生長速度明顯加快，但OD值隨之降低。根據菌種活力以及穩定性等多方面因素考慮，選擇30 ℃、pH7.0為枯草芽孢桿菌的最適條件。

2.2 乳酸菌生長條件測定

乳酸菌同樣屬于細菌的一個分支厚壁菌門，乳酸菌是飼料中應用最早、最廣泛的菌類，在飼料中發揮以下作用：產生抗菌素抑制和殺滅有害菌使其不能生長繁殖，減少或殺滅有害物質，使動物體內毒素含量降低從而增強使原宿主抗異能力，增強在競爭中占優勢；提高飼料的營養價值，在活菌體內和代謝產物中含有較高的超氧化物歧化酶可以增強動物的體液免疫和細胞免疫；將糖類分解改善物料風味和適口性。

通過圖3、圖4 可以看出，在32 ℃和35 ℃培養溫度下，乳酸菌的生長速率相差不大，在37 ℃時，乳酸菌生長速率明顯增高，但最終OD 值略低于采用35 ℃進行培養；在不同pH培養基環境下，前期菌液的OD 值并未呈現出非常明顯的差別，但隨著培養時間的延長，高pH 的試驗組OD 值開始呈現不同程度的下降趨勢。根據菌種活力以及穩定性等多方面因素考慮，選擇35 ℃、pH5.0為乳酸菌的最適條件。

2.3 玉米秸稈與豆粕混合發酵參數測定

由于試驗因素較多，對全部因子進行交互試驗，費時費力，因此，利用minitab 軟件進行輔助，設計部分因子試驗，以之前試驗出的乳酸菌和枯草芽孢桿菌最適生長條件為界限，擬定試驗因子為pH(最小值5.0、最大值7.0)、溫度(最小值30 ℃、最大值35 ℃)、水分(最小值35%、最大值40%)、乳酸菌接種量(最小值1‰、最大值5‰)、枯草芽孢桿菌接種量(最小值1‰、最大值5‰)，具體設計如下：每個試驗組重復進行三次試驗，在發酵過程第1、3、7、15 d分別對各試驗組取樣進行顏色、氣味、酸度、水分、微生物數量等檢測、并根據各試驗組發酵水平，進行綜合評定，將綜合評定值平均平均數返回設計軟件，通過回歸方程，經層層刪減，計算各因子影響性（表1-2）。

通過軟件計算，得出模型及回歸方程，其R-sq=99.63%、R-sq（調整）=99.06%，說明刪去所有影響不顯著項后的模型結構較好，回歸方程具有較好的預測能力。其控制方程式（精簡模式）如下：綜合評定值=6.2062+0.1812 水分-0.0312pH+0.1438 溫度 +0.9313 乳酸菌接種量-0.6187 枯草芽孢桿菌接種量-0.1812水分×溫度-0.0813pH×乳酸菌接種量+0.1937pH×枯草芽孢桿菌接種量-0.1063溫度×枯草芽孢桿菌接種量（圖5）。

通過效應Pareto 可以看出，試驗的關鍵因子為D、E、BE、A、AC、C、CE、BD，即乳酸菌接種量、枯草芽孢桿菌接種量、pH×枯草芽孢桿菌接種量、水分、水分×溫度、溫度、溫度×枯草芽孢桿菌接種量、pH×乳酸菌接種量（圖6）。

通過主效應圖可以看出，乳酸菌接種量和枯草芽孢桿菌接種量的斜率較大，說明其對發酵的影響顯著，水分、溫度、pH的斜率較為平緩，說明其對發酵的影響不顯著。因子的重要順序為D＞E＞A＞C＞B（乳酸菌接種量＞枯草芽孢桿菌接種量＞水分＞溫度＞pH）。

通過交互作用圖可以看出，水分與pH、水分與溫度之間存在著一定的交互作用外，其余因子間不存在明顯的交互作用關系（圖7-8）。

通過相應優化器，利用控制方程式對數據進行計算，得出最佳操作水平為pH 5.5、溫度35 ℃、配料水分40%、乳酸菌接種量5‰、枯草芽孢桿菌接種量1‰。

采用最佳操作水平數據對進行試驗，以驗證結果的穩定性，通過試驗發現，在發酵15 d時，飼料具氣味芳香，顆粒松散，乳酸菌活菌數＞4×10⁷CFU/g，枯草芽孢桿菌活菌數＞2×10⁷ CFU/g最終評價值為8.9，優于其他試驗組。

由于研究方向以及設備儀器的原因，本次實驗主要對發酵飼料感官評價及益生菌數量，進行了比較，并未對發酵前后的小肽類、氨基酸類等微量營養成分，以及飼料的消化能。代謝能等進行詳細檢測，后續我們將對飼料發酵前后小肽、氨基酸、微量元素的變化，并開展動物飼喂研究，以找出最優發酵方案。

結 論

經過初步研究，采用pH5.5、溫度35 ℃、配料水分40%、乳酸菌接種量5‰、枯草芽孢桿菌接種量1‰作為工藝條件進行發酵時，能獲得較高的益生菌數量和較優的感官評價結果，發酵效果較好。